Blue Native PAGE凝膠電泳常見問(wèn)題
Blue Native PAGE凝膠電泳常見問(wèn)題
1. 在非變性條件下，使用Blue
Native PAGE凝膠進(jìn)行非變性電泳比使用Tris-甘氨酸凝膠具有哪些優(yōu)勢(shì)？
需要使用非離子洗滌劑進(jìn)行增溶的樣品不能兼容傳統(tǒng)的非變性Tris-甘氨酸PAGE，因?yàn)殡S著蛋白質(zhì)在聚丙烯酰胺凝膠中的遷移，會(huì)將非離子洗滌劑遺留在條帶上方。當(dāng)缺少非離子洗滌劑時(shí)，蛋白質(zhì)會(huì)聚集并在泳道頂部形成垂直線條。當(dāng)使用藍(lán)色非變性電泳（Blue Native PAGE凝膠）時(shí)，Coomassie G-250可顯著減少蛋白質(zhì)的聚集，有效分離膜上的蛋白質(zhì)復(fù)合物，達(dá)到Tris-甘氨酸凝膠上得不到的效果。此外，與Tris-甘氨酸系統(tǒng)的工作pH（pH 9.3–9.5）相比，Blue
Native PAGE凝膠較低的工作pH（pH 7.5–7.7）有助于維持堿性pH敏感型蛋白質(zhì)的非變性結(jié)構(gòu)和/或活性。
2. Blue
Native PAGE凝膠應(yīng)如何保存？
我們推薦將其保存在4-8℃。不可冷凍。
3. Blue
Native PAGE凝膠的蛋白分離范圍是多少？
3-12%RealPAGE Native BN/CN 預(yù)制膠可分離分子量在45–10,000 kD范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。
4-16%RealPAGE Native BN/CN 預(yù)制膠可分離分子量在25–10,000 kD范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。
4. Blue
Native PAGE凝膠的推薦樣品上樣體積和蛋白質(zhì)上樣量是多少？
我們提供的預(yù)制膠是12孔，每個(gè)孔的最大上樣體積為30 μl，推薦每個(gè)泳道的蛋白含量范圍在20-50 μg。
5. 我的Blue Native PAGE凝膠在電泳過(guò)程中停止電泳了,為什么？該如何繼續(xù)電泳？
在Blue Native
PAGE凝膠電泳期間，電流下降至低于1 mA很常見。有些電泳電源如伯樂(lè)電源有負(fù)載檢查功能，電流過(guò)低（低于4mA） 會(huì)認(rèn)為沒有負(fù)載，報(bào)錯(cuò)E1錯(cuò)誤代碼，終止電泳。解決方法是更換電泳電源，如使用國(guó)產(chǎn)電源；另外可以調(diào)高電壓高于300 V，使得電流不要低于4mA。
6. Blue Native電泳有配套的蛋白Marker嗎？
推薦使用RTD6137 非變性電泳蛋白質(zhì)Marker（45-880 kD），RTD6142 高分子量非變性電泳蛋白質(zhì)Marker II（45-669 kD）或者RTD6144 寬分子量非變性電泳蛋白質(zhì)Marker 21-880 kD。然而由于凝膠濃度較低，低于45 kD條帶會(huì)壓在前沿，可能不可見。
在Blue Native
PAGE電泳中，不能使用預(yù)染分子量Marker，因?yàn)樗械念A(yù)染蛋白分子量Marker都是經(jīng)過(guò)變性和還原的，在非變性凝膠上不能良好分離。
請(qǐng)注意，即使使用非變性分子量Marker，在非變性電泳中的分子量預(yù)估也是非常不精確的，因?yàn)楦鞯鞍踪|(zhì)的不同電荷和結(jié)構(gòu)會(huì)嚴(yán)重影響凝膠遷移。為獲得更精確的預(yù)估，可使用質(zhì)譜分析或排阻層析（SEC）。
7. 你們推薦對(duì)Blue Native PAGE凝膠使用哪種染色方法？
Blue Native PAGE凝膠可兼容大多數(shù)標(biāo)準(zhǔn)Coomassie
R-250或G-250染料配方。推薦使用FastBlue蛋白染色液（貨號(hào)：RTD6202）。
8.
5% G-250染料的作用是什么？是否含有洗滌劑？
5% G-250染料（貨號(hào)BC260）是一種濃縮型Coomassie G-250儲(chǔ)液，專為與含有洗滌劑（非離子型）的Blue Native
PAGE凝膠電泳樣品一起使用而設(shè)計(jì)。該染料不含洗滌劑。正常情況下，非變性蛋白在凝膠上的遷移取決于凝膠緩沖液pH下的自然電荷/等電點(diǎn)，但是，加入Coomassie G-250會(huì)使蛋白質(zhì)產(chǎn)生負(fù)電荷，即使是通常具有正電荷的高pI蛋白質(zhì)也能帶上負(fù)電。該添加劑能夠與蛋白質(zhì)非特異性結(jié)合，能夠保持蛋白的非變性狀態(tài)。
9. 你們推薦選擇哪種轉(zhuǎn)膜緩沖液用于Blue Native PAGE凝膠轉(zhuǎn)??？
我們推薦選擇10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：BC600P）用于Blue Native PAGE凝膠轉(zhuǎn)印。PVDF是推薦使用的印跡膜，具有良好的轉(zhuǎn)印和檢測(cè)效果。硝酸纖維素膜（NC膜）不能兼容Blue Native PAGE凝膠轉(zhuǎn)印，這是因?yàn)橄跛崂w維素膜可與Coomassie
G-250染料發(fā)生緊密結(jié)合，很難脫離干凈。
10. 對(duì)于Blue Native PAGE凝膠，你們推薦的轉(zhuǎn)膜條件是什么？
由于Blue Native
PAGE電泳基本關(guān)注的是分子量比較大的蛋白或復(fù)合體，推薦使用濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（貨號(hào)：RT-ZY01），不推薦用半干轉(zhuǎn)方法轉(zhuǎn)膜。使用BN轉(zhuǎn)膜緩沖液，以下轉(zhuǎn)膜條件僅供參考，客戶針對(duì)自己的目的蛋白，最好經(jīng)過(guò)1-2次預(yù)實(shí)驗(yàn)后，確定最佳的轉(zhuǎn)膜條件。
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蛋白大小
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穩(wěn)流
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建議時(shí)間
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降溫措施
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低于70kD
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150 mA
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1 小時(shí)
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不需要
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70-300 kD
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200 mA
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1.5-2 小時(shí)
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需要
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高于300 kD
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200 mA
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2.5-3.5 小時(shí)
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需要
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11. 凝膠轉(zhuǎn)膜后，我的PVDF膜染上藍(lán)顏色了怎么辦？
由于電泳緩沖液和上樣緩沖液中含有考馬斯亮藍(lán)G-250，凝膠轉(zhuǎn)膜后PVDF膜會(huì)有藍(lán)色痕跡，可以把膜浸泡在無(wú)水甲醇中漂洗幾分鐘，去除藍(lán)色。
12. 非變性Marker轉(zhuǎn)到膜上看不到條帶，Western Blot檢測(cè)后我如何判斷條帶大小呢？
有兩種方法可以解決非變性Marker轉(zhuǎn)膜后條帶顯示問(wèn)題：
第一種方法：凝膠轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色液（貨號(hào)：RTD6301）染膜，可以看到Marker條帶，順便可以檢測(cè)轉(zhuǎn)膜效率，然而要注意的是麗春紅染色靈敏度比較低，可能不能完全看到完整的Marker條帶。
注：北京師范大學(xué)惠贈(zèng)圖片
第二種方法（下圖）：電泳結(jié)束后，把含有Marker泳道的凝膠切下，單獨(dú)用FastBlue蛋白染色液（貨號(hào)：RTD6202）染色，剩余的凝膠去完成轉(zhuǎn)膜到ECL發(fā)光檢測(cè)過(guò)程，最后的發(fā)光結(jié)果和Marker染色結(jié)果拼接判斷條帶范圍。
Jurkat細(xì)胞BN電泳 GAPDH檢測(cè)
電泳：1×藍(lán)色電泳緩沖液（含0.01% G-250）
穩(wěn)壓150V 43分鐘；1×無(wú)色電泳緩沖液 穩(wěn)壓150V 35分鐘
轉(zhuǎn)膜：1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（不含甲醇），穩(wěn)流200 mA
（電壓72-60V） 1.5小時(shí)，未冰浴
膜漂洗去藍(lán)色：PVDF膜無(wú)水甲醇浸泡10分鐘至膜無(wú)色
封閉：無(wú)蛋白快速封閉（貨號(hào)：
PF1070），RT，30分鐘
一抗：GAPDH兔多抗（貨號(hào)：
RGA1040），1：5000 過(guò)夜孵育
二抗：羊抗兔IgG-HRP（貨號(hào)：
HGR1020） 1：5000 RT 1小時(shí)
ECL檢測(cè)：ECL發(fā)光（貨號(hào)：
EC2520），曝光3.5 min