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電泳還原與非還原區(qū)別

電泳還原與非還原區(qū)別

 

聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)為網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),具有分子篩效應(yīng),它有兩種形式:非變性電泳(Native-PAGE)和變性電泳(SDS-PAGE)。非變性電泳,在電泳的過程中,蛋白質(zhì)能夠保持完整狀態(tài),并依據(jù)蛋白質(zhì)的分子量大小、形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開;而變性電泳(SDS-PAGE)僅根據(jù)蛋白質(zhì)亞基分子量的不同分開蛋白質(zhì)(可以忽略電荷因素)。SDS是陰離子去污劑,作為變性劑和助溶試劑,它能斷裂分子內(nèi)和分子間的氫鍵,使分子去折疊,破壞蛋白分子的二、三級結(jié)構(gòu)。

強還原劑,如巰基乙醇、二硫蘇糖醇(DTT)能使半胱氨酸殘基間的二硫鍵斷裂。有些蛋白含有二聚體或多聚體,如果加入β-巰基乙醇,它會還原多聚蛋白之間和內(nèi)部的二硫鍵,這樣,電泳的樣品將會被完全還原成單體甚至亞基形式,不加還原劑的樣品則會保持聚體的形式。

SDS-PAGE有非還原SDS-PAGE和還原SDS-PAGE之分,均是變性條件下的電泳。非還原與還原的區(qū)別是在樣品處理時是否加入還原劑(如β-巰基乙醇或DTT等)。

在進行電泳方法選擇時,首先要明確目標蛋白的結(jié)構(gòu)特點,以及電泳目的預(yù)期,來決定是否需加入還原劑。

如需測定目標蛋白的純度及分子量(為多聚體分子量),則一般采用非還原SDS-PAGE:采用該電泳方法,二聚體、多聚體在凝膠中的位置會處于單體分子量2倍或多倍的位置,利于觀察及各組分的定性定量分析。當(dāng)然這種蛋白的聚體形成是依靠二硫鍵來維持的。

如果僅需測定蛋白質(zhì)亞基結(jié)構(gòu)的分子量,則需采用還原SDS-PAGE,將二聚體、多聚體降解為單體,理想情況下,若還原充分,僅可見亞基條帶。

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